本发明涉及一种用于皮肤损伤修复、具有良好三维多孔结构和抗凝血真皮支架的制备，该支架制备所用原料为三种天然生物材料：再生丝素蛋白、壳聚糖和肝素，其中，肝素具有优异的抗凝血性能，该真皮支架具有高的孔隙率和适宜真皮细胞长入的孔径尺寸，该支架有较好的力学性能和良好的亲水性，该人工真皮支架具有肝素缓释功能，使得其凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间都显著延长，证明其具有优良的抗凝血性。
1.一种人工真皮支架的制备方法，其特征在于，制备步骤如下：1)制备0.2M的醋酸溶液：将1.2g醋酸溶解于去离子水中，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液；2)制备肝素溶液：在0.2M的醋酸溶液中溶解一定质量的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值；3)制备壳聚糖/肝素溶液：取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解一定量的壳聚糖，使其浓度为3～5％，得到乳白色的粘稠液体；4)制备丝素蛋白溶液：使溶液中丝素蛋白的浓度为4％；5)制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液：将步骤3制备的壳聚糖/肝素溶液加入步骤4制备的丝素蛋白溶液中，使丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为1:3～3:1，总浓度为3～5％，搅拌15min，混合均匀；6)模具成型：将步骤5制备的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，并放置在-20℃冰箱中冷冻24h，再置于冷冻干燥机中冷冻干燥48h；7)甲醇处理：将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，弃去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇，最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料,其中，丝素蛋白与壳聚糖质量比为1:3～3:1，人工真皮支架中的肝素含量为0.01％～0.1％。技术领域
本发明属于医疗器械领域。更确切地说，本发明涉及一种用于皮肤损伤修复、具有良好三维多孔结构和抗凝血性的人工真皮支架的制备方法。技术背景皮肤是人体最大的器官，具有保持人体内水分、防止过度散热、透气和防止细菌侵袭的功能。在人体受到外伤、烧伤、炎症等损害时，尤其是当大面积的皮肤受到严重的烧伤或损害时，伤口应该立即被保护起来。如果仅是皮肤的浅层或是小面积受损，新皮肤会自体得以再生，但如果受到严重的创伤，皮肤就不能靠自己修复，通常须将身体其他部位的表层皮肤移植到伤口上。由于没有可替代的皮肤来源，治疗上多采用自体皮肤移植，如邮票植皮、网状植皮、嵌皮等方法——医生需要从他们身体其它部位取下一块完好的皮肤，重新植入创伤部位。尽管能治愈创面，但在取皮部位却留下了新的创伤，常常导致疤痕增生，甚至因取皮过深，供皮区难以自愈，形成水疱和溃疡，导致治好了旧伤又添了新伤。遇到大面积严重烧伤的病人，如果其正常皮肤所剩无几，缺乏自体皮肤来及时封闭创面，常常引起创面及全身严重的感染等一系列并发症，有可能危及生命。目前，国外已经产业化的人工皮肤产品，包括Integra、Biobrane、Dermagraft等，在临床上已经有大量的使用。国内经过十多年的研究，第四军医大学金岩教授项目组的一个产品进入产业化，目前已开始正式进入临床应用。先进的人工皮肤大多具有表皮层和真皮层，当其植入损伤部位后，半渗透的表皮层能起到保护、透气和防止细菌侵袭等作用。而真皮层具有三维多孔支架结构，在术后2～3周，随着支架不断降解，成纤维细胞和毛细血管长入三维结构，在充足的血供下，长入的细胞保持高的活力，细胞分泌出胶原蛋白，真皮得以重建。在上述人工皮肤使用中，细胞长入重建的过程很大程度上取决于毛细血管长入的情况，有了充足的血供，细胞进行正常的周期，才能分泌丰富的胶原蛋白，使真皮得以迅速的重建。在皮肤创伤愈合的过程中，有大量的血小板在伤口聚集，容易产生凝血作用，在小伤口处产生凝血有利于伤口的俞合。然而，在较大面积皮肤的创伤中，需要在人工皮肤的辅助下修复时，如果产生大量的凝血作用、出现疤痕、使人工皮肤的真皮层与坏死组织接触，不利于毛细血管向支架长入。因此，开发新型的人工皮肤支架使其具有良好的三维结构及抗凝血性，具有重要的意义。发明内容：本发明的目的在于提供一种用于皮肤损伤修复、具有良好三维多孔结构和抗凝血性的人工真皮支架。本发明的人工真皮支架由天然生物材料制成。本发明的人工真皮支架由再生丝素蛋白、壳聚糖和肝素制成。本发明所制备的人工真皮支架中，丝素蛋白与壳聚糖质量比为1∶3～3∶1。本发明所制备的人工真皮支架中的肝素的含量为支架质量的0.01％～0.1％。本发明制备的人工真皮支架也可以称为丝素蛋白/壳聚糖/肝素人工真皮支架。本发明的另一个目的在于提供本发明的人工真皮支架的制备方法。本发明的人工真皮支架制备步骤如下：1.制备0.2M的醋酸溶液；2.制备肝素溶液；3.制备壳聚糖/肝素溶液；4.制备丝素蛋白液；5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液；6.模具成型；7.甲醇处理，即得。本发明中，人工真皮支架具有三维多孔结构，孔隙率为85～98％，孔径在100～250μm之间。该支架压缩模量为2.5～3.8MPa，压缩强度为150～480kPa，显示出好的力学性能。该支架具有大的溶胀率(45～70％)和高的吸水率(220～360％)，表现出良好的亲水性。优选的本发明的人工真皮支架制备步骤如下：本发明的人工真皮支架制备步骤是：1.制备0.2M的醋酸溶液：将1.2g醋酸于用去离子水中溶解，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液。2.制备肝素溶液：在醋酸溶液中溶解一定质量的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。3.制备壳聚糖/肝素溶液：取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解一定量的壳聚糖，使其浓度为3～5％，得到乳白色的粘稠液体。4.制备丝素蛋白溶液：使溶液中丝素蛋白的浓度为4％。5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液：将步骤3制备的壳聚糖/肝素溶液加入步骤4制备的丝素蛋白溶液中，使丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为1∶3～3∶1，总浓度为3～5％，搅拌15min，混合均匀。6.模具成型：将步骤5所制的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入的聚四氟乙烯模具中，样品在-20℃冷冻24h后，再于冷冻干燥机里冷冻干燥48h(-54℃，80Pa)。7.甲醇处理：将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料。本发明的人工真皮支架的凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间分别≥42.2±2.8s、≥32.5±4.1s和≥119.1±6.7s，比未加肝素的支架(分别为17.8±1.8s、12.3±1.1s和35.0±1.0s)相比，均有较大的提高，说明所制人工真皮支架的抗凝血性显著改进。最优选的制备方法在实施例中。本发明所制备的人工真皮支架具有缓释肝素的性能。在体外释放的前7天，大约50％的肝素被释放，其余部分结合在支架内部，随着壳聚糖的降解而逐渐被释放。释放出的肝素保持好的活性。本发明所制备的人工真皮支架中，因为肝素的加入使得其凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间与未加肝素的支架相比都显著提高，表明其优良的抗凝血性。本发明的人工真皮支架与现有技术相比成本低廉，制备方法简单，适合大规模生产；具有优良的三维结构，适宜细胞和毛细血管的长入，具有抗凝血因子的缓释功能，减小支架中的凝血，保持分泌细胞的活性，修复性强。
具体实施方式
下面将结合实施例进一步说明本发明的人工真皮支架，但不作为本发明的限制。实施例1丝素蛋白和壳聚糖的比例为1∶3，含肝素0.01％的丝素蛋白/壳聚糖/肝素人工真皮支架制备如下：1.制备0.2M的醋酸溶液。将1.2g醋酸于去离子水中溶解，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液。2.制备肝素溶液。在40mL步骤1制备的醋酸溶液中溶解0.16mg的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。3.制备3％壳聚糖/肝素溶液。取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解1.2g的壳聚糖，得到乳白色的粘稠液体。4.制备丝素蛋白溶液。使溶液中丝素蛋白的浓度为4％。5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液。将步骤3制备的40mL醋酸/肝素溶液加入步骤4制备的9mL丝素蛋白/壳聚糖混合溶液中，则丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为1∶3，总浓度为4％，搅拌15min，混合均匀。6.模具成型。将步骤5所制的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，样品在-20℃冷冻24h后，再于冷冻干燥机里冷冻干燥48h(-54℃，80Pa)。7.甲醇处理。将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料，其中，丝素蛋白和壳聚糖的比例为1∶3，含肝素0.01％。所制人工真皮支架的孔隙率为96.5％，压缩模量为2.77MPa，压缩强度为177kPa。该支架溶胀率为56.2％，吸水率为270％，具有良好的亲水性。该支架的凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间分别为42.2±2.8s、32.5±4.1s和119.1±6.7s，比未加肝素的支架(分别为17.8±1.8s、12.3±1.1s和35.0±1.0s)相比，均有较大的提高，说明所制人工真皮支架具有良好的抗凝血性。实施例2丝素蛋白和壳聚糖的比例为3∶1，含肝素0.04％的丝素蛋白/壳聚糖/肝素人工真皮支架制备如下：1.制备0.2M的醋酸溶液。将1.2g醋酸于去离子水中溶解，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液。2.制备肝素溶液。在40mL步骤1制备的醋酸溶液中溶解2mg的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。3.制备3％壳聚糖/肝素溶液。取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解1.2g的壳聚糖，得到乳白色的粘稠液体。4.制备丝素蛋白溶液。使溶液中丝素蛋白的浓度为4％。5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液。将步骤3制备的40ml壳聚糖/肝素溶液加入步骤4制备的80mL丝素蛋白溶液中，则丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为3∶1，总浓度为3.3％，搅拌15min，混合均匀。6.模具成型。将步骤5所制的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，样品在-20℃冷冻24h后，再于冷冻干燥机里冷冻干燥48h(-54℃，80Pa)。7.甲醇处理。将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料，其中，丝素蛋白和壳聚糖的比例为3∶1，含肝素0.04％。所制人工真皮支架的孔隙率为90.4％，压缩模量为2.83MPa，压缩强度为185kPa。该支架溶胀率为67％，吸水率为254％，具有良好的亲水性。该支架凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间分别大于60s、50s和150s，比未加肝素的支架(分别为17.8±1.8s、12.3±1.1s和35.0±1.0s)相比，均有显著的提高，说明所制人工真皮支架具有良好的抗凝血性。实施例3丝素蛋白和壳聚糖比例为1∶1，含肝素0.1％的丝素蛋白/壳聚糖/肝素人工真皮支架制备如下：1.制备0.2M的醋酸溶液。将1.2g醋酸于去离子水中溶解，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液。2.制备肝素溶液。在在40mL步骤1制备的醋酸溶液中溶解2.4mg的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。3.制备3％壳聚糖/肝素溶液。取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解1.2g的壳聚糖，得到乳白色的粘稠液体。4.制备丝素蛋白溶液。使溶液中丝素蛋白的浓度为4％。5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液。将步骤3制备的壳聚糖/肝素溶液加入30mL步骤4制备的丝素蛋白溶液中，则丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为1∶1，总浓度为3.4％，搅拌15min，混合均匀。6.模具成型。将步骤5所制的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入的聚四氟乙烯模具中，样品在-20℃冷冻24h后，再于冷冻干燥机里冷冻干燥48h(-54℃，80Pa)。7.甲醇处理。将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料，其中，丝素蛋白和壳聚糖的比例为1∶1，含肝素0.1％。所制人工真皮支架的孔隙率为92％、压缩模量为3.12MPa，压缩强度为348kPa。该支架溶胀率为50.3％，吸水率为236％，具有良好的亲水性。凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间分别大于60s、大于50s和大于150s，比未加肝素的支架(分别为17.8±1.8s、12.3±1.1s和35.0±1.0s)相比，均有较大的提高，说明所制人工真皮支架具有良好的抗凝血性。实施例4丝素蛋白和壳聚糖的比例为3∶1，含肝素0.04％的丝素蛋白/壳聚糖/肝素人工真皮支架制备如下：1.制备0.2M的醋酸溶液。将1.2g醋酸于去离子水中溶解，滴定至100mL，得到0.2M的醋酸溶液。2.制备肝素溶液。在40mL步骤1制备的醋酸溶液中溶解2mg的肝素，再用醋酸滴定至肝素加入之前溶液的pH值。3.制备5％壳聚糖/肝素溶液。取40mL步骤2制备的肝素溶液，溶解2g的壳聚糖，得到乳白色的粘稠液体。4.制备丝素蛋白溶液。使溶液中丝素蛋白的浓度为5％。5.制备丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液。将步骤3制备的40ml壳聚糖/肝素溶液加入步骤4制备的120mL丝素蛋白溶液中，则丝素蛋白与壳聚糖的质量比例为3∶1，总浓度为5％，搅拌15min，混合均匀。6.模具成型。将步骤5所制的丝素蛋白/壳聚糖/肝素混合溶液倒入聚四氟乙烯模具中，样品在-20℃冷冻24h后，再于冷冻干燥机里冷冻干燥48h(-54℃，80Pa)。7.甲醇处理。将冷冻干燥后的样品从模具中取出，甲醇浸泡6h后，倒去甲醇，并继续冷冻干燥48h除去剩余的甲醇。最后得到膜状的丝素蛋白/壳聚糖/肝素共混支架材料，其中，丝素蛋白和壳聚糖的比例为3∶1，含肝素0.04％。所制人工真皮支架的孔隙率为85.1％，压缩模量为3.84MPa，压缩强度为475kPa。该支架溶胀率为45％，吸水率为220％，具有良好的亲水性。该支架凝血酶原时间、部分凝血活酶时间和凝血酶时间分别大于60s、50s和150s，比未加肝素的支架(分别为17.8±1.8s、12.3±1.1s和35.0±1.0s)相比，均有显著的提高，说明所制人工真皮支架具有良好的抗凝血性。